Als Sohn eines Weinhändlers wird Karel Dujardin am 27. September 1626 getauft. Über seine Ausbildung ist nichts bekannt, jedoch werden in der Forschung Nicolaes Berchem, Pieter van Laer und Paulus Potter als Lehrer in Erwägung gezogen. Dujardins Frühstil zeichnet sich durch eine fein detaillierte Faktur aus, Vorbilder sind Sebastien Bourdon und Paulus Potter. In den Landschaften nimmt er ab den späten 1640er Jahren Tendenzen von Pieter van Laer und Nicholas Berchem auf. Die meist kleinformatigen Gemälde sind delikat komponiert und von atmosphärischer Qualität durchdrungen. 1649 heiratet Dujardin in Paris Suzanna van Roy, zwei Jahre später ist er wieder in Amsterdam, wo er zusammen mit seiner Frau ein Testament verfasst. Um 1656 übersiedelt Dujardin nach Den Haag, wo er Mitbegründer der "Confrerie Pictura" wird und sich 1657 der Miliztruppe "Colombyne Vendel" anschließt. Im Mai des Jahres 1659 ist der Maler erneut in Amsterdam, seine Gemälde sind dort ab den 1660er Jahren gesucht. Seinen Ruhm zu Lebzeiten belegen nicht nur die hohen Preise seiner Arbeiten, sondern auch die Aufnahme in das biografische Werk "Het Gulden Cabinet" von Cornelis de Bie aus dem Jahr 1661. In den 1660er Jahren entwickelt Dujardin panoramahafte Landschaften, die von Jan Asselijn inspiriert scheinen. Zudem entstehen eine Reihe meist großformatiger Historiengemälde - biblische und mythologische Szenen sowie komplexe Allegorien -, in denen Dujardin sich zunehmend ehrgeizigeren künstlerischen Herausforderungen stellt. Neben anderen Malern begutachtet er 1672 für den Kurfürsten von Brandenburg die italienischen Gemälde der Sammlung Reynst. Mit seinem Freund Joan Reynst besucht er 1675 die Insel Texel, und reist nach Aufenthalt im nordafrikanischen Tanger weiter nach Italien, wo er seine Malweise entschieden verändert. Dramatischer und grober, mit starken Schatten und unmodulierten Oberflächen erinnern seine Arbeiten nun an Salvator Rosa und die Nachahmer von Annibale Carracci. Oft sind es auf Fernsicht angelegte Flusslandschaften mit Reisenden. In seinen letzten drei Lebensjahren arbeitet der Maler in größerem Umfang als je zuvor. 1678 zieht Dujardin nach Venedig, wo er erkrankt und wenig später stirbt.